Dr. Martina Seiffert

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Die Immun-Mikroumgebung in B-Zell-Lymphomen

Abb. 1: Schematische Darstellung der Hauptbestandteile des Tumor-Microenvironments und deren Interaktionen mit den malignen B-Zellen bei CLL.
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Das sogenannte Tumor-Microenvironment umfasst die Zellen, extrazelluläre Matrix und löslichen Faktoren in der unmittelbaren Nähe der Tumorzellen. Diese Mikroumgebung spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von B-Zell-Lymphomen. Im Fall der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL) induzieren Faktoren des Tumor-Microenvironments in sekundären lymphatischen Organen das Überleben und die Proliferation der malignen B-Zellen (siehe Abb. 1). CLL Zellen im peripheren Blut vermehren sich hingegen nicht. In Kultur überleben diese Zellen auch nur, wenn sie externe Signale aus ihrer Umgebung erhalten (Seiffert et al., 2010 und Schulz et al., 2011). Die Interaktion zwischen Tumorzellen und den nicht-malignen Zellen in ihrer Umgebung ist aber keine Einbahnstraße: Tumorzellen formen ihre Mikroumgebung. So modellieren sie Immunzellen wie T-Zellen und myeloische Zellen in einer Leukämie-fördernden und immunsuppressiven Weise (zusammengefasst in Hanna et al., 2017). Mit unserer Forschung wollen wir die Mechanismen dieser Kommunikation aufklären. Folgende Fragen sollen dabei beantwortet werden:

  • Wie gelangen Signale von einer Zelle zur anderen?
  • Welche Zellen im Microenvironment vermitteln die Leukämie-fördernden Signale?
  • Welche Immunzellen sind involviert und wie wird deren Aktivität unterdrückt?

Neue Krebsmedikamente, die auf die Interaktion zwischen malignen und nicht-malignen Zellen abzielen oder regulatorische Moleküle auf Immunzellen blockieren, zeigen vielversprechende Ergebnisse in klinischen Studien. Da CLL und andere B-Zell-Lymphome besonders von ihrer Mikroumgebung abhängig sind, könnten Medikamente die diese Kommunikation stören, zur Mobilisierung der malignen Zellen aus ihren protektiven Nischen und dadurch zum Zelltod der Krebszellen führen. Reaktivierung der anti-Tumor Immunantwort könnte dazu beitragen, die Tumorzellen zu eliminieren. Mit unserer Arbeit wollen wir daher neue Zielstrukturen für Therapien in der Mikroumgebung identifizieren und testen.

Welche Rolle spielen Exosomen bei der Modulation des Tumor-Microenvironments?

Abb. 2: A. Elektronenmikroskopie-Analyse der von CLL Zellen produzierten EVs. B. Konfokale Mikroskopie-Analyse von fluoreszierenden CLL Exosomen (grün) nach deren Aufnahme durch Makrophagen (filamentöses Aktin in rot, Zellkern in blau). C. Monocyten, die mit CLL Exosomen behandelt wurden, zeigen erhöhte PD-L1 Expression, gemessen mittels Durchfusszytometrie. D. Der von uns vorgeschlagene Mechanismus erklärt wie CLL Exosomen nach deren Aufnahme durch Monozyten eine inflammatorische und immunsuppressive Mikroumgebung, die die Leukämieentwicklung unterstützt, schaffen. Haderk et al. 2017
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Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind wichtige Mediatoren bei der Kommunikation zwischen Zellen und in viele physiologische und pathologische Prozesse involviert. In den EVs enthaltene Proteine und RNA Moleküle können mittels Fusion oder Endozytose der EVs auf Zielzellen übertragen werden. In den Zielzellen ist das übertragene Material aktiv und kann zelluläre Veränderung hervorrufen. Von Tumorzellen abgegebene EVs repräsentieren einen neuen Mechanismus für interzelluläre Kommunikation, der es den Krebszellen erlaubt, ihre Mikroumgebung zu beeinflussen.

Wir haben ein neues, standardisiertes Protokoll etabliert, um mit Hilfe einer Serie von Zentrifugationsschritten, Exosomen sowohl aus dem Blut von CLL Patienten und gesunden Spendern, als auch aus den Kulturüberständen von CLL Zelllinien zu isolieren. Mittels Elektronenmikroskopie und Western Blot Analysen konnten wir von CLL Zellen abstammende EVs mit einer Größe von 30-350 nm identifizieren (Abb. 2A). Diese sind positiv für Exosomenmarker wie RAB5a und HSP70 (Haderk et al., 2013). Mittels Massenspektrometrie und RNA-Sequenzierung konnten wir zudem den Protein- und RNA-Inhalt der CLL Exosomen bestimmen. Hierbei stellten wir fest, dass die nicht-kodierende Y RNA hY4 in CLL Exosomen angereichert ist. Dieses RNA Molekül führt mittels TLR7 Aktivierung zu phänotypischen Veränderungen, wie Zytokin-Freisetzung und erhöhter PD-L1 Expression, in den Hauptzielzellen der CLL Exosomen: Monozyten und Makrophagen (Abb. 2B+C). Dadurch entsteht ein entzündliches und Tumor-unterstützendes Milieu (Abb. 2D) (Haderk et al. 2017).

Momentan konzentriert sich unsere Arbeit darauf, die Rolle von Tumor-Exosomen bei der Entwicklung und dem Verlauf von CLL und anderen B-Zell-Lymphomen zu entschlüsseln.

Immunsuppressive Mechanismen myeloischer Zellen

Abb. 3: A. Maligne B-Zellen aus der Milz leukämischer Eµ-TCL1 Mäuse können in syngene wildtyp (WT) Mäuse transferiert werden und lösen dort eine CLL-ähnliche Krankheit aus. B. Nach der Transplantation (Tx) reichern sich mit der Leukämieentwicklung sogenannte patroullierende Monozyten, die mittels Durchflusszytometrie basierend auf ihrer Expression von Ly6C und CD43 identifiziert werden können, in der Milz der Empfängertiere an. C. Depletion von myeloischen Zellen mittels Clodronat-Liposomen verlangsamt die Leukämieentwicklung nach TCL1 Tumorzelltransfer, hier gezeigt anhand des Gewichts der Milz, in welcher die malignen Zellen vornehmlich akkumulieren. Hanna et al., 2016.
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Um die Komplexität der Mikroumgebung in B-Zell-Lymphomen in vivo zu untersuchen, verwenden wir das transgene Eμ-TCL1 (TCL1) Mausmodell für CLL (Abb. 3A) (Bichi et al., 2002). In diesen Mäusen ist die Entwicklung von CLL mit einem systemischen, entzündlichen Zytokin-Milieu und Veränderungen innerhalb der Verteilung und Aktivität myeloischer Zellen verbunden (Abb. 3B) (Hanna et al., 2016), was unsere Beobachtungen in CLL Patienten bestätigt (Seiffert et al.,2010; Schulz et al., 2011). Monozyten und Makrophagen weisen einen entzündlichen und Tumor-unterstützenden Phänotyp auf, der sich durch die Freisetzung von Zytokinen und die Expression von immunsuppressiven Molekülen wie PD-L1 auszeichnet. Chemische Depletion von Monozyten und Makrophagen in diesen Mäusen verlangsamt die Krankheitsentwicklung und repariert krankheitsassoziierte T-Zelldefekte (Abb. 3C) (Hanna et al., 2016), was die onkogenen Eigenschaften von myeloischen Zellen in CLL hervorgehebt.

Unsere zukünftigen Studien zielen darauf ab, die pathogene Rolle der myeloischen Zellen zu entschlüsseln. Myeloische Zellen weisen eine enorme Plastizität auf. Im Tumor-Microenvironment nehmen diese Zellen verschiedene Tumor-unterstützende und immunsuppressive Phänotypen an, wie z.B. Tumor-assoziierte Makrophagen (TAMs) und myeloide Suppressorzellen (MDSCs). Laufende Einzelzellanalysen werden dazu beitragen, die Rolle dieser verschiedenen Zelltypen zu klären.

T-Zellerschöpfung in B-Zell-Lymphomen

Abb. 4: A. Nach Transplantation (Tx) von malignen TCL1 B-Zellen entwickelt sich die Leukämie schneller in Rag2-/- Mäusen, denen T- und B-Zellen fehlen, verglichen mit wildtyp (WT)-Mäusen (gezeigt als Anzahl der CLL Zellen im Blut), und leukämische Rag2-/- Mäuse sterben früher. Hanna et al., 2018. B. Die Entwicklung von CLL ist mit einer Akkumulation von oligoklonalen CD8+ Effektor-T-Zellen, die eine heterogene PD-1 Expression haben, assoziiert. Die Sequenzierung des T-Zellrezeptor-Lokus zeigte Oligoklonalität von PD-1 exprimierenden Effektorzellen, jedoch nicht von naiven oder Gedächtnis (Mem)-T-Zellen. C. Einzelzell-RNA-Sequenzierungen der CD8+ T-Zellen von leukämischen TCL1 Mäusen identifizierte 8 deutlich abgegrenzte Zell-Cluster basierend auf deren differentiell exprimierter Gene (Analyse mit Seurat Package, Satija Labor). Mittels „Pseudotime“-Analyse dieser Daten (nach Monocle, Trapnell Lab) konnte ein Entwicklungszusammenhang der Zell-Cluster vorgeschlagen werden. B+C. Manuskripte in Bearbeitung.
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T-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des Tumorwachstums. Ohne T-Zellen entwickelt und verläuft CLL viel schneller, wie gesehen bei der Übertragung von Eμ-TCL1 Leukämiezellen in Rag2-/- Mäuse, die keine reifen B- und T-Zellen ausbilden (Abb. 4A). Dies führte dazu, dass leukämische Rag2-/- Mäuse früher sterben als Wildtyp-Mäuse mit gleicher Behandlung (Abb. 4A). Genauer betrachtet zeigte sich, dass CD8+ Effektor-T-Zellen die CLL Entwicklung kontrollieren (Hanna et al., 2018).

Auf lange Sicht gelingt es diesen tumorspezifischen Effektor-T-Zellen aber nicht, die malignen B-Zellen vollständig zu vernichten. Sie zeigen vielmehr Anzeichen einer aktivierungsbedingten Erschöpfung, sowohl in Mausmodellen (McClanahan et al., 2016; Hanna et al., 2018) als auch in CLL Patienten (Ramsay et al., 2008; Riches et al., 2013). Dieser Erschöpfungszustand geht mit einer verstärkten Expression inhibitorischer Rezeptoren wie PD-1, KLRG-1, 2B4 und LAG3, beeinträchtigten Immunsynapsenbildung und verringerten Zytotoxizität einher.

Unser Ziel ist es, Mechanismen der T-Zellerschöpfung zu entschlüsseln. Wir haben bereits Marker identifiziert, die eine Untergruppierung von funktional und klonal unterschiedlichen T-Zellsubtypen für deren detaillierte Charakterisierung ermöglicht (Abb. 4B). Zusätzlich untersuchen wir verschiedene Mediatoren im Tumor-Microenvironment, wie z.B. IL-10, und deren Rolle bei der T-Zellerschöpfung.

Um eine höhere Auflösung der zellulären Unterschiede während der graduellen Erschöpfung und ein besseres Verständnis der Funktion einzelner T-Zellen im Kontext der Mikroumgebung des B-Zell-Lymphoms zu erzielen, führen wir Einzelzell-RNA-Sequenzierungen durch (Abb. 4C).

Präklinische Immuntherapie-Studien

Abb. 5: Behandlung mit anti-PD-L1 Antikörpern verlangsamt den Leukämieverlauf nach Transplantation von TCL1 Leukämiezellen in Empfängertieren. Maligne B-Zellen akkumulieren unter anderem in der Milz. Ein geringeres Milzgewicht und weniger CD19+CD5+ leukämische Zellen in der Milz, dem Blut (PB), Knochenmark (BM) und Peritoneum (PC) zeigen weniger Krankheitsbelastung in mit Antikörpern behandelten Tieren. McClanahan&Hanna et al., 2015.
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Angesichts der Rolle, die Immunzellen und -mediatoren in der Mikroumgebung von B-Zell-Lymphomen spielen (siehe oben), untersuchen wir das Potenzial neuer therapeutischer Substanzen, die auf das Immunsystem abzielen.

Vorarbeiten aus unserem und anderen Laboren haben gezeigt, dass CLL und die damit verbundenen Veränderungen innerhalb der Mikroumgebung sehr gut im Eμ-TCL1 Mausmodell und nach Transplantation dessen maligner B-Zellen gespiegelt werden. Daher verwenden wir diese Modelle, um die Relevanz von Krankheits-modellierenden Zellsubtypen, Genen oder Signalwegen zu analysieren. Die zu untersuchenden Kandidaten stammen aus unseren Studien mit myeloischen Zellen und T-Zellen.

Ein Ansatz, um die Bedeutung verschiedener Zelltypen zu testen, ist die spezifische Depletion/Abtötung von Zellsubtypen mit Antikörpern oder in transgenen Mauslinien. Darüber hinaus testen wir Stoffe, die identifizierte Kandidatengene oder Signalwege gezielt hemmen oder aktivieren, entweder als Monotherapie oder in Kombination mit bereits zugelassenen Medikamenten wie Ibrutinib, PI3Kd-Inhibitoren oder Immun-Checkpoint-Inhibitoren.

Immun-Checkpoint-Blockade zielt darauf ab "ruhig gestellte" Immunzellen wieder zu aktivieren und wird als neuer Therapieansatz gegenwärtig für Lymphome getestet. Im TCL1 Transplantationsmodell haben wir gezeigt, dass das Blockieren des immunsuppressiven PD-1/PD-L1 Immun-Checkpoints zu einer verbesserten T-Zell-Funktion und Leukämie-Kontrolle führt (Abb. 5) (McClanahan&Hanna et al., 2015).

Resistenzmechanismen gegen gezielte Therapie und Immun-Checkpoint-Blockade

Abb. 6: A. Behandlung von leukämischen Mäusen nach Transplantation von TCL1 Leukämiezellen mit Ibrutinib (Ibr) führte zur Kontrolle der Leukämie, gemessen an der Zahl der CD5+CD19+ Zellen im Blut, im Vergleich zu Mäusen die mit dem Lösungsmittel (Veh) behandelt wurden. Nach 3-4 Wochen entwickelten die Mäuse eine Resistenz gegen das Medikament und die CLL Zellen expandierten. B. Eine Woche nach Behandlungsstart, inhibierte Ibrutinib die Proliferation der Leukämiezellen drastisch (gemessen via Ki-67). Sechs Wochen nach Behandlungsstart zeigen die Leukämiezellen eine ähnliche Proliferationsrate wie die Kontrolltiere (Veh in der Woche 3). Manuskript in Bearbeitung.
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Behandlung mit neuartigen, zielgerichteten Medikamenten, wie dem Bruton-Tyrosinkinase (Btk)-Inhibitor Ibrutinib oder dem Bcl-2-Antagonisten Venetoclax verbesserte das Behandlungsergebnis für CLL Patienten erheblich. Leider werden aber zunehmend Resistenzen gegen diese Therapien beobachtet. Immun-Checkpoint-Blockade mit Antikörpern, die auf PD-1 oder PD-L1 abzielen, war in ersten klinischen Studien mit CLL Patienten nicht wirksam. Die Gründe für dieses unerwartete Versagen des Therapieansatzes sind unklar.

Wir untersuchen Mechanismen der Therapieresistenz im Eµ-TCL1 Mausmodell (Abb. 6), indem wir Leukämiezellen, sowie die Immunzellen in der Mikroumgebung, vor und nach Resistenzentwicklung vergleichen. Die gewonnenen Ergebnisse werden mit Daten aus klinischen Studien verglichen, mit dem Ziel, das Potenzial neuer Kombinationstherapien zu bewerten und das Ergebnis besagter Therapieansätze für CLL Patienten zu verbessern.

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