Kryokonservierung von Embryonen

Abb 2

Kryokonservierung niedriger Embryonalstadien (aus: Schenkel, Transgene Tiere 2. Auflage 2006, ISBN-10 3-540-28267-X, mit freundlicher Genehmigung des Springer-Verlags, Heidelberg)
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Die Embryonen werden den superovulierten Spendertieren entnommen, in ein Röhrchen mit Medium und Glyzerin als Gefrierschutz geladen, in einem steuerbaren Einfriergerät auf -32°C gekühlt und dann in LN2 zeitlich unbegrenzt gelagert. Um eine Linie wieder zu erhalten, müssen entsprechend Embryonen revitalisiert und in eine scheinträchtige Amme zum Austragen transferiert werden.
Zur ausreichenden Kryokonservierung benötigen wir je nach Genotyp mindestens 200 bis 500 Embryonen, das sind im Mittel 20 bis 50 Spendertiere, diese Zahl kann allerdings im Einzelfall erheblich höher sein. Die Ausbeuten sind abhängig von

  • Tierhaltung/Umweltbedingungen
  • Genetischer Hintergrund
  • Alter des männlichen Tiers
  • Alter des weiblichen Tiers
  • Möglichen Phänotypen
  • Pheromonische Effekte
  • Häufigkeit der Verpaarungen
  • Hygienischer Zustand der Tiere
  • Jahreszeit, extreme Wetterlagen

Die Kryokonservierung von zwei- bis achtzelligen Embryonen hat sich als „Gold Standard“ erwiesen, man erhält nach Revitalisierung und Embryotransfer genau das Tier wieder, das man eingefroren hat. Die von uns angewendete Technik wurde von Schwab und Schenkel (2008a) publiziert.
Die Überprüfung der Qualität der Kryokonservierung ist notwendig, aber nur mit dem Verlust der Probe möglich, was bei schlechten Embryonenausbeuten problematisch ist. Wir revitalisieren routinemäßig etwa 10% einer kryokonservierten Linie mit mindestens einem qualitativen Embryotransfer, bei dem zur Kontrolle die Nachkommen genotypisiert werden. Parallel dazu werden Übernachtkulturen angesetzt, in denen die revitalisierten Embryonen ins nächste Stadium kommen müssen. Bei niedrigen Revitalisierungraten muss die Zahl der einzufrierenden Embryonen erhöht werden. Eine Re-genotypisierung der Spendertiere ist nicht möglich, wenn nicht-transgene Hintergrundtiere als Embryonenspender verwendet werden.
Die durchschnittliche Revitalisierungsrate liegt bei über 80% der aufgetauten Embryonen. Durch den Sanierungseffekt des anschließenden Embryotransfers können die Tiere direkt in der Zielhaltung unter den dortigen hygienischen Verhältnissen ausgetragen werden. Diese Technologie lässt sich mit unterschiedlichen Ausbeuten bei fast allen genetischen Hintergründen von Mäusen erfolgreich anwenden.

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