ES-Zell Kultur / Targeting

Bild embryonale Stammzellen

Kultur embryonaler Stammzellen
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Diese Technik erlaubt eine spezifische genetische Modifikation an einer ausgewählten chromosomalen Position durch homologe Rekombination in ES-Zellen.

  • Tag 1: Herstellung von ES-Zell-Medium mit LIF (Leukämie inhibierender Faktor) und Aussäen von Feederzellen (inaktivierte embryonale Fibroblasten aus Maus)
  • Tag 2: Auftauen und Aussäen von embryonalen Stammzellen auf Platten mit Feederzellen
  • Tag 4: Subkonfluente ES Zellkolonien werden 2x mit PBS gewaschen und mit Trypsin behandelt, um eine Einzellzellsuspension herzustellen. ES Zellen entweder 1:4 aussäen oder 5x10E6 Zellen mit 20-50µg Targeting Konstrukt (DNA) elektroporieren
  • Tag 5: Beginn der Selektion (z.B. mit G418)
  • Tag 14: Isolierung einzelner ES-Zellklone
  • Später: Teilung der ES-Zellklone. 2/3 jedes Klons wird bei -80°C eingefroren; aus 1/3 des Klons wird DNA extrahiert, um genetisch veränderte Klone mittels PCR Nachweis oder Southern Blotting herauszufinden

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