CRISPR/Cas Technik (Endonuklease vermittelte Genom Editierung)

Injektion von CRISPR/Cas Reagenzien in einen 1-Zell Mausembryo (Zygote)
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Mit diesere Technik kann man eine gezielte genetische Veränderung im Mausgenom erzeugen. Je nach verwendeter Methode können Insertions/Deletions erzeugt werden und/oder DNA Sequenzen (Stop codon, loxP sites, GFP sequence etc.) in das Mausgenom eingebracht werden.

Embryo Gewinnung

  • Superovulation von Spenderweibchen durch i.p. Injektion von Gonadotropin und 48h später Chorionic Gonadotropin => Ovulationsauslösung
  • Verpaarung mit fertilen Böcken ü.N.
  • Identifizierung der gedeckten Weibchen durch VP-Kontrolle
  • Tötung der Weibchen durch zervikale Disslokation, Entnahme des Eileiters und Präparation der Embryonen unter dem Mikroskop
  • Entfernung der Kumuluszellen durch kurzzeitige Behandlung mit Hyaluronidase
  • Waschung der Embryonen in Medium und Inkubation im CO2-Brutschrank

CRISPR/Cas Injektion

  • Überführung von 20-30 Embryonen in einen mit Silikonöl überschichteten Mediumtropfen in der Injektionskammer
  • Fixierung eines Embryos durch Unterdruck an einer Haltekapillare
  • Injektion von CRISPR/Cas Reagenzien in das Zytoplasma oder einen der beiden Vorkerne des einzelligen Embryos (Zygote)
  • Inkubation der injizierten Embryonen in einem CO2-Brutschrank für 1-2h oder über Nacht

Transfer der injizierten Embryonen

  • Verpaarung von Ammen mit vasektomierten Böcken => scheinschwangere Weibchen
  • Übertragung der injizierten Embryonen im Ein- oder Zweizell-Stadium mittels Transferkapillare in den Eileiter der scheinschwangeren Ammenmäuse
  • Nachweis des transgenen Status der geborenen Jungtiere

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