Einführung

Definition

Bei gentechnisch modifizierten (transgenen) Mäusen ist das Erbgut mittels gentechnischer Methoden verändert worden.


Genetisch veränderte DNA Sequenzen, können entweder an zufälliger Stelle (DNA-Vorkerninjektion) oder zielgerichtet (CRISPR/Cas Technik und ES-Zell-Mikroinjektion) in ein Empfängergenom übertragen werden. Die fremde DNA kann in die Wirts DNA eingebaut werden und das "neue" Gen kann ein funktionales Protein exprimieren oder die Expression eines endogenen Gens kann verändert werden (z.B. still gelegt werden / Knock-out).

 

Drei Methoden werden hauptsächlich für die Herstellung genetisch veränderter Mäuse verwendet.

Pronukleare Mikroinjektion in Zygoten

Bei der DNA Mikroinjektion wird fremde DNA in die Vorkerne von befruchteten Maus-Eizellen (Zygoten) injiziert. Den so behandelten Embryo bringt man anschließend in den Eileiter einer Ammenmaus. Ein Teil der Embryonen entwickelt sich nach der Implantierung in der Gebärmutter bis zur Geburt weiter. Von den neugeborenen Mäusen hat ein Teil die fremde DNA in den eigenen Chromosomen integriert. Diese Tiere nennt man transgene Mäuse.

CRISPR/Cas Technik

Bei der CRISPR/Cas Technik (Endonuklase vermittelte Genom Editierung) werden RNA (gRNA und Cas9 mRNA) und DNA (Template) in den Vorkern oder in das Zytoplasma einer befruchteten Mauseizelle (Zygote) injiziert. Die injizierten Embryonen werden danach in den Eileiter einer Ammenmaus transferiert. Ein Teil der Embryonen entwickelt sich nach der Implantierung bis zur Geburt weiter. Bei der Injektion von gRNA und Cas9 mRNA entstehen durch den Mechanismus des "non-homologous end joining (NHEJ)" Indel Mutanten (Insertion oder Deletion einzelner Nukleotide). Wird zusätzlich eine DNA als Template injiziert, entstehen durch den Mechanismus "homology directed repair (HDR)" Mutanten mit z.B. einem Stop Codon, loxP Sites oder GFP Seqenzen an definierter Stelle im Mausgenom.

Mikroinjektion von ES Zellen in Blastozysten

ES-Zell Targeting

Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) sind Zellen, die ursprünglich aus einem frühen Mausembryo isoliert worden sind. Bei der ES-Zell-Kultivierung / beim "targeting", lässt man die ES-Zellen auf Nährzellen (inaktivierte Mausfibroblasten) und in Anwesenheit von Leukämie-inhibierendem-Faktor (LIF) wachsen. Auf diese Weise verhindert man die Differenzierung. Mittels Elektroporation schleust man ein "targeting" Konstrukt in ES-Zellen ein. Dadurch kann an definierter Stelle im Genom ein bestimmtes Gen genetisch verändert werden.

Mikroinjektion in Blastozysten

Die elektroporierten ES-Zellen werden in Mausembryonen (Blastozysten) injiziert, wo sie in den sich entwickelnden Embryo integrieren. Der bedeutendste Vorteil dieser Technik ist, dass sich ES-Zellen, die das Transgen enthalten, vor der Injektion selektieren lassen. Man kann dadurch genetisch veränderte Mäuse mit Mutationen in bestimmten Genen erzeugen (z.B. Knockout-Mäuse).

nach oben